液氮研磨是一種利用液氮（-196°C）的極低溫度使生物組織瞬間脆化，再通過機械力將其粉碎成精細粉末的物理方法。它在分子生物學、蛋白質組學、代謝組學等研究中至關重要，能有效防止樣本降解并提高分子提取效率。以下是詳細操作步驟與關鍵注意事項：

一、實驗目的

• 快速、高效地粉碎新鮮或冷凍的生物組織（動物、植物、微生物）。

• 最大限度保持組織內核酸、蛋白質、代謝物等目標分子的完整性和活性。

• 抑制內源性酶活（如RNases、DNases、蛋白酶），減少降解。

• 為后續的核酸/蛋白質提取、代謝物分析等提供均質化的起始材料。

二、實驗原理

液氮的極低溫使組織中的水分瞬間結晶，導致組織物理結構變得極其脆弱（“低溫脆化”）。此時施加機械研磨力，脆化的組織很容易被粉碎成細小的顆粒或粉末。整個過程在低溫下快速進行，顯著降低了熱敏性分子降解的風險。

三、所需材料與設備

1. 核心設備：

• 研缽與研杵： 最好使用厚重、專為低溫設計的瑪瑙研缽或不銹鋼研缽（耐低溫沖擊）。研杵應匹配研缽大小。

• 液氮罐/杜瓦瓶： 用于儲存和傾倒液氮，需有良好保溫性能。

• 保溫盒/泡沫盒： 用于盛放研缽并臨時存放液氮，提供操作平臺，減少液氮快速揮發。

2. 樣品與耗材：

• 待研磨組織樣本： 新鮮組織或保存在-80°C的組織（取出后立即處理）。

• 液氮： 足量。

• 預冷的樣品管/離心管： 用于收集研磨好的粉末（推薦1.5mL或2mL離心管，提前置于冰上或-80°C預冷）。

• 預冷的藥勺/刮刀： 用于轉移粉末。

• 鑷子/剪刀： 用于處理組織塊。

3. 防護裝備（至關重要！）：

• 低溫防護手套： 專用液氮操作手套或厚實的皮/棉手套（切勿使用普通乳膠/丁腈手套，無法防凍傷）。

• 實驗服/防護服： 保護身體。

• 護目鏡/面罩： 防止液氮飛濺入眼。

• 防凍鞋/封閉鞋子： 保護腳部。

• 長褲。

4. 其他：

• 記號筆（標記樣品管）。

• 冰盒/干冰。

• 通風良好的操作空間。

四、操作步驟詳解

1. 準備工作：

• 佩戴防護裝備： 務必戴好低溫手套、護目鏡/面罩、穿好實驗服和長褲、防凍鞋。

• 環境準備： 確保操作區域通風良好（避免液氮氣體積聚導致缺氧），清潔干燥，無雜物。

• 預冷設備： 將研缽和研杵放入保溫盒中。緩慢、少量地倒入液氮，直至研缽底部被覆蓋。讓研缽和研杵在液氮中浸泡預冷數分鐘（至少3-5分鐘）。研杵可用鑷子夾住浸入液氮。注意： 傾倒液氮時動作要慢，防止劇烈飛濺。

• 組織準備： 將新鮮組織切成盡可能小的塊（< 0.5 cm3），或從-80°C冰箱取出冷凍組織塊（避免解凍）。若組織塊太大，可先置于液氮中速凍幾秒使其硬化，再用預冷的研缽或錘子敲碎成小塊。

2. 預冷研磨：

• 用預冷的鑷子小心夾取一小塊組織（不要一次研磨太多組織，避免研缽溫度快速上升）。

• 將組織塊迅速投入預冷好的研缽中。組織塊接觸液氮會劇烈沸騰（屬于正常現象）。

3. 初步破碎：

• 迅速用預冷的研杵垂直、輕柔但有力地敲擊組織塊。此時組織因低溫脆化，很容易碎裂成較小的顆粒。注意： 避免劇烈敲擊導致組織粉末飛濺出研缽或液氮劇烈噴濺。

4. 持續研磨：

• 關鍵操作： 當研缽內的液氮幾乎揮發完（沸騰停止或很少），組織顆粒開始有變軟或粘連趨勢時，立即、少量地沿研缽壁緩緩加入新的液氮（避免直接倒在粉末上引起飛濺）。再次淹沒組織顆粒。

• 待液氮平穩（沸騰減弱）后，用研杵用力、快速、畫圈研磨（像碾藥一樣）。利用研杵與研缽壁的擠壓和摩擦力將顆粒磨細。

• 重復“液氮揮發 -> 少量添加液氮 -> 用力研磨”的循環過程，直至組織被研磨成細膩、均勻、干燥的粉末狀（通常需要添加液氮3-6次，具體次數取決于組織量和韌性）。

5. 收集樣品：

• 當最后一次加入的液氮幾乎完全揮發（粉末呈干燥蓬松狀，無可見液體或冰晶），但粉末仍處于極低溫狀態時（這是防止復溫降解的關鍵！），迅速用預冷的藥勺或刮刀將粉末刮起。

• 立即將粉末轉移至預冷的樣品管/離心管中。

• 迅速蓋緊管蓋，并立即置于液氮、干冰或-80°C冰箱中保存，或立即進行下一步提取操作。

6. 清理：

• 讓殘留液氮在通風處自然揮發完全。

• 用純水或適當的溶劑清洗研缽和研杵，徹底干燥后存放。

• 妥善處理廢棄物。

五、關鍵注意事項與安全警示

1. 安全第一（重中之重！）：

• 嚴防凍傷： 液氮溫度極低，皮膚直接接觸會造成嚴重凍傷（類似燙傷）。務必全程佩戴合格的低溫防護手套、護目鏡/面罩，穿好防護服、長褲和防凍鞋。 避免皮膚任何部位暴露。

• 防止窒息： 液氮氣化會迅速膨脹（體積膨脹約700倍），大量揮發可能置換空氣導致局部缺氧。必須在通風良好的環境中操作！ 切勿在密閉小空間使用大量液氮。

• 防爆沸/飛濺： 向研缽添加液氮時，務必緩慢、少量、沿壁加入。熱的物體或水進入液氮會引發劇烈沸騰和飛濺，極其危險。確保所有接觸液氮的器具（研缽、研杵、鑷子、藥勺、樣品）完全干燥無水！

• 防容器脹裂： 絕對禁止將液氮密封在任何容器中（如擰緊蓋子的離心管）。氣化產生的巨大壓力會導致容器爆炸。

• 輕拿輕放： 處理盛有液氮的容器要小心，避免劇烈震動或傾倒。

2. 操作效率與樣品質量：

• 組織量適中： 一次研磨的組織量不宜過多（通常< 100mg - 1g，視研缽大小定），否則難以磨勻且研缽升溫快。

• 保持低溫： 研磨過程中要密切觀察液氮量，在組織粉末未復溫軟化前及時補充液氮。一旦粉末變濕、結塊或變粘，表明溫度已升高，分子降解風險劇增。

• 快速轉移： 粉末收集動作要極其迅速，在粉末仍處于超低溫干燥狀態時完成轉移和冷凍保存。

• 預冷一切： 研缽、研杵、鑷子、藥勺、樣品管都必須充分預冷，減少熱量引入。

• 組織特性： 脂肪含量高或纖維特別堅韌的組織更難研磨，可能需要更多次液氮添加和更大力道。

3. 設備選擇：

• 研缽和研杵應足夠厚重以承受低溫沖擊和研磨力，瑪瑙最佳（惰性、耐磨），不銹鋼次之。避免使用薄壁玻璃研缽（易碎）。

六、應用范圍

• 提取高質量總RNA、mRNA（尤其防止RNase降解）。

• 提取基因組DNA、質粒DNA。

• 提取總蛋白、磷酸化蛋白等，用于Western Blot、質譜分析。

• 提取代謝物，用于代謝組學分析。

• 制備均質化的組織樣品用于酶活性測定、小分子分析等。

總結： 液氮研磨是破壞堅硬生物組織、獲取高質量生物分子的強大工具，但其核心在于安全操作和全程維持低溫。熟練掌握“少量組織、充分預冷、及時補氮、快速研磨、低溫轉移”的要領，并嚴格遵守安全防護規范，是成功進行液氮研磨實驗的關鍵。對于通量要求高的實驗室，也可考慮使用自動化的冷凍研磨儀（球磨儀），但手動液氮研磨在靈活性、成本和控制精細度上仍有其獨特優勢。